Plate-forme microfluidique pour la détection en temps réel du SARS-CoV-2

Covid-19 a fait naître le besoin de méthodes de détection des virus rapides, précises et à grande échelle. Les tests de masse se sont avérés efficaces pour réduire la prévalence de la maladie. Cependant, les diagnostics RT-qPCR de référence, qui nécessitent un personnel spécialisé et un environnement biomédical, ne peuvent être déployés dans les zones à forte densité de population et dans les pays en développement. Un appareil portable pour un dépistage viral massif et rapide est hautement souhaitable.

La conception et l'ingénierie d'une plateforme de microanalyse pour la détection de la charge virale SARS-CoV-2 dans des échantillons de salive humaine, sans recours à l'amplification de l'acide nucléique. Le système cible fournira un dépistage intégré, comprenant l'extraction de l'ARN des échantillons collectés, la capture des séquences virales par des surfaces de détection sensibles et spécifiques, et la lecture par microscopie optique à fluorescence.

Nous avons d'abord mis au point un dispositif microfluidique multicomposant pour banc d'essai, composé d'un puits d'entrée, d'une chambre de prétraitement pour l'extraction de l'ARN, d'une chambre de criblage chargée de biocapteurs d'ADN et d'un puits de sortie permettant la lecture par microscopie à fluorescence numérique des événements d'hybridation.

À partir d'une vaste collection de données de séquençage du SARS-CoV-2 (NCBI Nucleotide GenBank), une approche par fenêtres glissantes a permis d'identifier 1 000 sondes ADN ciblant des régions hautement polymorphes du génome du SARS-CoV-2 d'une longueur comprise entre 20 et 50 pb. La sélection in silico a permis d'identifier une sonde d'ADN ss de 24 pb de long, spécifique du virus SARS-CoV-2.

Nous avons mis en œuvre des stratégies de fonctionnalisation covalentes pour la conjugaison de la sonde ADN sélectionnée à des lames de borosilicate nues ou recouvertes d'amine. Une variation des unités d'espacement, y compris des composants moléculaires, peptidiques et polymériques, a fourni une méthodologie efficace pour régler avec précision la densité d'hybridation à la surface de détection de l'ADN, avec l'une des densités les plus élevées rapportées jusqu'à present.

En utilisant des échantillons de salive contenant des concentrations décroissantes de virus SARS-CoV-2, nous avons établi la limite de détection du dispositif de dépistage à six copies par ml (correspondant à 10 aM). En outre, l'absence de signal de lecture pour les échantillons de salive contenant le virus MERS a démontré la capacité de discrimination du système. Après validation de la plate-forme du banc d'essai, nous avons conçu un prototype préindustriel du dispositif de dépistage, intégrant le microscope à fluorescence, le circuit microfluidique et le dispositif de mesure de la bioimpédance. Les développements actuels comprennent une nouvelle conception de l'unité de détection et l'extension des capacités de dépistage à d'autres pathogènes viraux.

La plateforme développée ici permet de dépister le SARS-CoV-2 dans la salive humaine sans avoir recours à l'amplification de l'ARN viral et avec un temps d'analyse total de moins de 15 minutes. Grâce au dispositif automatisé et intégré, le traitement des échantillons et la détection sont accessibles au personnel non spécialisé et peuvent être utilisés en dehors des environnements biomédicaux. La stratégie de fonctionnalisation est indépendante de la séquence de la sonde ADN immobilisée.

Développement d’une plate-forme microfluidique pour la détection en temps réel du SARS-CoV-2 à l’aide de biocapteurs multifonctions à membrane en silice