Mikrofluidplattform zum Echtzeitnachweis von SARS-CoV-2

Mit dem Auftreten und der Ausbreitung von Covid-19 entstand der Bedarf an schnellen, genauen und breit anwendbaren Nachweisverfahren. Massentests haben sich als effizient erwiesen, um die Prävalenz der Krankheit zu verringern. Die RT-qPCR-Diagnostik, kann jedoch in Gebieten mit hoher Bevölkerungsdurchmischung und in Entwicklungsländern nicht eingesetzt werden. Die Entwicklung eines tragbaren Geräts für ein umfassendes und schnelles Virenscreening ist daher äusserst wünschenswert.

Ziel des Projekts war der Entwurf und die Entwicklung einer Mikroanalyseplattform für den Nachweis von SARS-CoV-2-Virusladungen in menschlichen Speichelproben ohne Nukleinsäureamplifikation. Das Zielsystem sollte einen automatischen und vollständig integrierten Screening-Workflow bieten, einschliesslich der RNA-Extraktion aus den gesammelten Proben, der Erfassung der viralen Sequenzen durch hochempfindliche und spezifische Sensoroberflächen und Auslesung durch optische Fluoreszenzmikroskopie.

Wir haben ein Mehrkomponenten-Mikrofluidgerät für den Prüfstand entwickelt, das aus einer Eingabemulde, einer Vorbehandlungskammer für die RNA-Extraktion, einer mit DNA-Biosensoren bestückten Screening-Kammer und einer Ausgabemulde besteht, die das Auslesen der Hybridisierungsereignisse an den Sensoroberflächen mittels digitaler Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht.

Aus einer Sammlung von Sequenzierungsdaten wurden mithilfe eines Sliding-Windows-Ansatzes 1.000 DNA-Sonden identifiziert, die auf hochpolymorphe Regionen des SARS-CoV-2-Genoms mit einer Länge zwischen 20 und 50 bp abzielen. Die In-silico-Auswahl wies auf eine 24 bp lange ssDNA-Sonde hin, die für das Virus spezifisch ist. Wir implementierten kovalente Funktionalisierungsstrategien für die Konjugation der DNA-Sonde an nackte oder aminobeschichtete Borosilikatobjektträger. Eine Variation der Abstandseinheiten ermöglichte eine effiziente Methodik zur Feinabstimmung der Hybridisierungsdichte an der DNA-Sensoroberfläche mit Werten zwischen 0,5 und 3,1 pmol-cm-2. Die Robustheit der chemischen Konjugationsansätze für die Immobilisierung von DNA-Sonden führte zu einer hohen Stabilität der Sensoroberflächen, die bis zu 4 Wochen bei 0°C gelagert werden können. Mit Speichelproben, die abnehmende Konzentrationen des Virus enthielten, ermittelten wir die Nachweisgrenze des Screening-Geräts bei 6 Kopien pro ml (entsprechend 10 aM). Auch das Fehlen eines Auslesesignals bei Speichelproben, die das MERS-Virus enthielten, beweist die Eliminationsfähigkeit und Spezifität des Systems. Nach der Validierung der Prüfstandsplattform haben wir einen vorindustriellen Prototypen des Screening-Geräts entwickelt, der das Fluoreszenzmikroskop, den mikrofluidischen Schaltkreis und den Bioimpedanz-Messaufbau integriert. Zu den aktuellen Entwicklungen gehören ein neues Design der Sensoreinheit, das den Anforderungen der Bioimpedanzauslesung entspricht, und die Erweiterung der Screening-Kapazitäten auf andere Viren.

Die Screening-Plattform ermöglicht ein SARS-CoV-2-Screening in Speichelproben ohne Rückgriff auf eine RNA-Amplifikation und mit einer Analysezeit von weniger als 15 Minuten. Probenverarbeitung und Detektionstechnologie sind für nicht spezialisiertes Personal zugänglich und können ausserhalb biomedizinischer Umgebungen betrieben werden. Die Funktionalisierungsstrategie ist unabhängig von der Sequenz der DNA-Sonde und bietet somit die Möglichkeit, die Technologie auf andere Viren anzuwenden.

Entwicklung einer Mikrofluidplattform für den Echtzeitnachweis von SARS-CoV-2-Viren mittels Biosensoren