Analyse von Protein-RNA-Komplexen von SARS-CoV-2

Grundlegende Aspekte der Wechselwirkungen zwischen Proteinen und RNA in Coronaviren sind bis heute unbekannt. Ein besseres Verständnis dieser Wechselwirkungen trägt zum Verständnis grundlegender Aspekte der Biologie des Virus bei und eröffnet zusätzliche Möglichkeiten für therapeutische Eingriffe. Wir untersuchten die Protein-RNA-Wechselwirkungen bei SARS-CoV-2, wobei wir das Nukleokapsid-Protein (N) und das Nicht-Strukturprotein 3 (Nsp3) als Ziele verwendeten.

Unser Ziel war es, solche strukturbiologischen Methoden zur Untersuchung von Protein-RNA-Interaktionen zwischen N und Nsp3 und ihren RNA einzusetzen. In einem ersten Schritt sollten die Bindungsstellen in diesen Protein-RNA-Komplexen lokalisiert und Modelle der Komplexe erstellt werden. Dann würden Verbindungen identifiziert, die an die Interaktionsregionen binden und somit in die Bindung zwischen den Partnern eingreifen. Diese Verbindungen können dann zu Medikamenten weiterentwickelt werden.

Wir kombinierten die Techniken der kernmagnetischen Resonanzspektroskopie (NMR) und der Vernetzung mit ultraviolettem Licht, gekoppelt mit Massenspektrometrie (XL-MS), um die Wechselwirkung des N-Proteins mit einer seiner Zielregionen im viralen Genom, dem s2m-Element, zu untersuchen. Zwei Teile des N-Proteins wurden getrennt untersucht, und es wurden Modelle beider Domänen im Komplex mit s2m erstellt. Damit haben wir Wirkstofffragmente identifiziert, die an die N-Protein-Domänen bzw. s2m binden. Die NMR-Spektroskopie identifizierte solche Kandidaten aus mehr als 600 Fragmenten und zeigte Strukturen auf, die weiterentwickelt werden können, um die Stärke der Bindung zu erhöhen und die pharmakologischen Eigenschaften zu verbessern. Mit Partnern aus dem NFP 78 versuchen wir mittels Röntgenkristallographie Strukturen der Proteindomänen und der RNA im Komplex mit solchen Wirkstofffragmenten zu erhalten.

Eine der Erkenntnisse anderer Forschungsgruppen war, dass das Nukleokapsid-Protein eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) durchläuft. Bei der LLPS bilden sich aus einer Lösung zwei flüssige Phasen in Form von dichteren Tröpfchen in einer umgebenden Flüssigkeit. Bei dem Coronavirus ist davon auszugehen, dass solche Prozesse für die Verpackung des RNA-Genoms im Virus und für die Replikation im Wirtsorganismus wichtig sind. Auf dieser Grundlage haben wir auch LLPS-Prozesse untersucht, an denen das N-Protein beteiligt ist. Erste Ergebnisse zeigen, unter welchen Bedingungen sich Tröpfchen bilden und wieder auflösen und welche Veränderungen im Protein und der interagierenden RNA bei einer Phasentrennung auftreten.

Bei unserem zweiten Ziel, Nsp3, haben wir Experimente zur Identifizierung von RNA-Bindungsregionen mit Modell-RNA durchgeführt. Die Entwicklung von Modellen erwies sich als schwieriger. Da bekannt wurde, dass Nsp3 auch mit dem N-Protein interagiert, begannen wir mit Experimenten, die eine Verbindung zwischen den Zielproteinen und der RNA-Bindung herstellen.

Wir konnten die Allgemeingültigkeit unseres Ansatzes nachweisen, indem wir erfolgreich Strukturen von Komplexen erzeugten und Moleküle identifizierten, die an die Ziele binden. Unser Ansatz wird für Pharmaunternehmen als alternativer Weg zur Entwicklung antiviraler Medikamente von Interesse sein. Darüber hinaus wächst das Interesse an LLPS rapide und bietet eine weitere Richtung für die Arzneimittelentwicklung, indem es in biologische Mechanismen eingreift, die eine Phasentrennung beinhalten.

Rapid Hybrid Structure Determination of Coronavirus Protein-RNA Complexes as a Basis for Drug Screening for the Treatment of COVID-19